| 【中文题名】 | 极细链格孢菌糖基化激活蛋白的纯化及其电喷雾质谱的分析 |
| 【英文题名】 | The Purification and ESI-MS Analysis of a Glycosylated Activator Protein from Alternaria Tenuissima |
| 【学科专业】 | 生物化学与分子生物学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2007-9-18 |
| 【中关键词】 | 极细链格孢菌,激活蛋白,分离纯化,糖基化,电喷雾质谱, |
| 【英关键词】 | Alternaria tenuissima,Activator Protein,Purification,Glycosylation,Electrospray Ionization Mass Spectrometry, |
| 【分类导航】 | 农业科学>植物保护>各种防治方法>生物防治>> |
| 【论文摘要】 |
从极细链格孢菌(Alternaha tenuissima)提取出来的激活蛋白具有诱导植物系统抗性的活性，SDS-PAGE显示主要有三个蛋白质条带，分子量分别为33kD，42kD和66kD。前期研究已证明，分子量为66kD左右的蛋白为糖蛋白，为了进一步研究该糖蛋白的性质及其作用机理，本文通过层析法等多种方法对该蛋白进行了纯化，获得了银染电泳级的纯品；利用TFMS化学法切除了O-连接的糖基，分析了其糖基修饰位点；在标准蛋白高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)分析技术体系基础上，建立了该糖基化激活蛋白的HPLC-ESI-MS分析体系，获得了精确分子量，经蛋白数据库搜索，初步推测该糖基化激活蛋白为一新型蛋白。具体结果如下：
用硫酸铵沉淀法结合乙醇沉淀法去除了影响蛋白纯化的真菌多糖，优化了柱层析纯化的缓冲液和洗脱条件，通过DEAE阴离子交换层析技术和梯度洗脱方式，以及Superdex75 10／300凝胶过滤层析纯化，获得了银染电泳纯的单一蛋白条带；利用液相等电聚焦结合SDS-PAGE技术，测得该糖基化蛋白的等电点为4.27。
采用TFMS化学法去除了该糖基化激活蛋白O-连接的糖... |
| 【论文题纲】 |
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摘要 |
5-6 |
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Abstract |
6-10 |
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第一章 绪论 |
10-23 |
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1.1 研究概述 |
10 |
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1.2 蛋白激发子种类及其在国内外研究进展 |
10-12 |
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1.2.1 过敏蛋白 Harpin |
10-11 |
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1.2.2 激发素 Elicitins |
11-12 |
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1.2.3 激活蛋白 (Activator) |
12 |
|
1.3 糖蛋白的结构功能及糖基化分析方法 |
12-16 |
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1.3.1 蛋白质糖基化的主要类型 |
12-13 |
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1.3.2 糖基化发生的特点及其分析技术的难点 |
13-14 |
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1.3.3 蛋白质糖基化研究的内容、技术和策略 |
14-15 |
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1.3.4 糖蛋白鉴定/糖基化位点确定方法 |
15-16 |
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1.4 电喷雾质谱在生物样品分析中的应用 |
16-21 |
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1.4.1 电喷雾电离过程 |
17-18 |
|
1.4.2 电喷雾电离质谱的分子质量的检测 |
18 |
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1.4.3 电喷雾电离质谱用于多肽与蛋白质分析 |
18-21 |
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1.5 高效液相色谱-质谱联用在激发子研究中的应用 |
21-22 |
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1.6 研究目的和意义 |
22-23 |
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第二章 糖基化激活蛋白的纯化及其理化性质的分析 |
23-38 |
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2.1 材料与仪器 |
23-24 |
|
2.1.1 试剂与材料 |
23-24 |
|
2.1.2 仪器 |
24 |
|
2.2 方法 |
24-32 |
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2.2.1 极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的培养与激活蛋白粗提液的制备 |
24 |
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2.2.2 激活蛋白的粗分离 |
24-25 |
|
2.2.3 蛋白浓度测定方法 |
25-26 |
|
2.2.4 糖基化激活蛋白的等电点分析 |
26-28 |
|
2.2.5 糖基化激活蛋白柱层析纯化方法的建立 |
28-30 |
|
2.2.6 糖基化激活蛋白的确定与去糖基化 |
30-31 |
|
2.2.7 糖基化激活蛋白的生物活性测定 |
31-32 |
|
2.3 结果与分析 |
32-37 |
|
2.3.1 糖基化激活蛋白的等电点 |
32 |
|
2.3.2 糖基化激活蛋白的柱层析纯化结果 |
32-35 |
|
2.3.3 糖基化激活蛋白的去糖基化 |
35 |
|
2.3.4 糖基化激活蛋白的生物活性测定 |
35-37 |
|
2.4 小结 |
37-38 |
|
第三章 模式蛋白溶菌酶和 BSA的高效液相-电喷雾质谱分析 |
38-49 |
|
3.1 材料与仪器 |
38-39 |
|
3.1.1 试剂、材料 |
38 |
|
3.1.2 仪器 |
38-39 |
|
3.1.3 生物样品 |
39 |
|
3.2 方法 |
39-41 |
|
3.2.1 溶剂及酸度的选择和仪器参数的优化 |
39 |
|
3.2.2 标准样品的HPLC分析 |
39-40 |
|
3.2.3 牛血清白蛋白(BSA)的酶解 |
40-41 |
|
3.2.4 标准蛋白的质谱分析条件 |
41 |
|
3.3 结果与讨论 |
41-48 |
|
3.3.1 溶剂及酸度的选择 |
41-42 |
|
3.3.2 仪器工作条件优化 |
42 |
|
3.3.3 标准蛋白纯品和混合物的HPLC分析结果 |
42-44 |
|
3.3.4 电喷雾质谱测定溶菌酶的相对分子质量 |
44-45 |
|
3.3.5 BSA酶解片段的ESI质谱分析结果 |
45-48 |
|
3.4 小结 |
48-49 |
|
第四章 糖基化激活蛋白的 HPLC-ESI-MS分析技术体系的建立 |
49-56 |
|
4.1 材料与仪器 |
49 |
|
4.1.1 试剂、材料 |
49 |
|
4.1.2 仪器 |
49 |
|
4.2 方法 |
49-50 |
|
4.2.1 HPLC分析条件 |
49-50 |
|
4.2.2 质谱条件 |
50 |
|
4.2.3 糖基化激活蛋白的酶解 |
50 |
|
4.2.4 数据分析 |
50 |
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4.3 结果与讨论 |
50-55 |
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4.3.1 糖基化激活蛋白的HPLC分析 |
50-51 |
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4.3.2 利用ESI质谱测定糖基化激活蛋白的相对分子质量 |
51-52 |
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4.3.3 糖基化激活蛋白酶解产物的RP-HPLC分离及ESI质谱分析 |
52-55 |
|
4.4 小结 |
55-56 |
|
第五章 结论 |
56-57 |
|
参考文献 |
57-63 |
|
致谢 |
63-64 |
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作者简历 |
64 |
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| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.152808 |
