| 【中文题名】 | 农杆菌介导的黑麦草丛生芽芽尖的遗传转化及转基因植株再生 |
| 【英文题名】 | |
| 【学科专业】 | 细胞生物学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2005-10-17 |
| 【中关键词】 | 一年生黑麦草,多年生黑麦草,丛生芽,遗传转化,betA,als |
| 【英关键词】 | Lolium multiflorum Lam.,Lolium perenne L.,multiple bud clumps,genetic transformation,betA,als, |
| 【分类导航】 | 农业科学>农作物>饲料作物、牧草>多年生禾本科牧草>黑麦草> |
| 【论文摘要】 | 黑麦草是具有世界栽培意义的禾本科牧草和草坪草,其遗传转化常用的方法是基因枪法,此外有硅碳纤维介导法以及农杆菌介导法,受体体系一般是经离体培养获得的胚性愈伤组织、悬浮细胞系和原生质体。目前黑麦草遗传转化方法尚存在一些缺点,如组织培养时间长、受基因型限制、愈伤组织经长期继代培养易出现体细胞无性系变异、转化周期长等,只从少数品种获得了少量的转基因植株。因此,建立一套高效、快速、不受基因型限制的黑麦草遗传转化体系是加快黑麦草基因工程发展的关键。
本工作以优良黑麦草栽培品种海湾(一年生)、泰垂莱特(多年生)的黄化丛生芽的裸露芽尖分生组织作为遗传转化的受体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,将来自大肠杆菌编码胆碱脱氢酶的betA基因转入两种基因型黑麦草细胞中,获得了可育的转基因植株。研究了影响黑麦草芽尖转化效率的因素,优化了转化体系。具体内容如下:
黑麦草离体丛生芽培养体系的建立:以黑麦草无菌种子苗的茎尖生长点部分为外植体,在附加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D的诱导培养基上诱导丛生芽发生,在附加2.0mg/L 6-BA的增殖培养基上继代培养,建立起高效的黑麦草丛生芽离体培养体系。... |
| 【论文题纲】 |
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摘要 |
7-9 |
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ABSTRACT |
9-11 |
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符号说明 |
11-12 |
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第一部分 前言 |
12-23 |
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1.1 黑麦草的生物学特性 |
12 |
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1.2 耐盐黑麦草的利用前景及研究意义 |
12-13 |
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1.3 黑麦草转基因技术研究的进展 |
13-18 |
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1.3.1 黑麦草遗传转化的受体系统 |
13-16 |
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1.3.1.1 愈伤组织培养 |
14-15 |
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1.3.1.2 悬浮细胞培养 |
15 |
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1.3.1.3 原生质体培养 |
15-16 |
|
1.3.2 黑麦草遗传转化方法 |
16-18 |
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1.3.2.1 基因枪轰击法 |
16-17 |
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1.3.2.2 硅碳纤维介导的直接基因转化 |
17 |
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1.3.2.3 原生质体直接吸入方法 |
17 |
|
1.3.2.4 农杆菌介导法 |
17-18 |
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1.4 黑麦草耐盐性研究和耐盐育种 |
18-21 |
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1.4.1 黑麦草耐盐性研究 |
19 |
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1.4.2 植物耐盐基因工程的策略 |
19-21 |
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1.5 除草剂抗性基因 |
21-22 |
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1.6 工作的目的和意义 |
22-23 |
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第二部分 材料与方法 |
23-32 |
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2.1 实验材料 |
23-26 |
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2.1.1 植物材料 |
23-24 |
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2.1.2 农杆菌 |
24 |
|
2.1.3 培养基 |
24-25 |
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2.1.4 药品、试剂及溶液 |
25-26 |
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2.2 方法 |
26-28 |
|
2.2.1 丛生芽体系的建立 |
26-27 |
|
2.2.1.1 外植体的获得 |
26 |
|
2.2.1.2 丛生芽块的诱导与继代 |
26-27 |
|
2.2.2 遗传转化 |
27-28 |
|
2.2.2.1 除草剂筛选浓度的确定 |
27 |
|
2.2.2.2 丛生芽组织块的转化、筛选和植株再生 |
27-28 |
|
2.2.2.4.1 农杆菌的培养 |
27-28 |
|
2.2.2.4.2 黑麦草丛生芽芽尖的浸染 |
28 |
|
2.2.2.4.3 芽尖的抑菌、筛选及植株再生 |
28 |
|
2.2.2.4.4 转基因苗的生根 |
28 |
|
2.3 转化植株的分子生物学检测 |
28-30 |
|
2.3.1 转化植株的PCR检测 |
28-30 |
|
2.3.2 转基因植株的PCR-Southern blotting检测 |
30 |
|
2.4 转基因芽和转基因植株的耐盐性分析 |
30-31 |
|
2.5 转基因植株后代的耐盐性检测 |
31 |
|
2.6 数据处理 |
31-32 |
|
第三部分 结果与分析 |
32-48 |
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3.1 黑麦草丛生芽体系的建立 |
32-35 |
|
3.1.1 丛生芽的诱导 |
32-33 |
|
3.1.2 丛生芽的增殖 |
33-34 |
|
3.1.3 生根与移栽 |
34-35 |
|
3.2 农杆菌介导的丛生芽芽尖的遗传转化 |
35-40 |
|
3.2.1 绿磺隆筛选浓度的确定 |
35-36 |
|
3.2.2 转化植株的获得 |
36-37 |
|
3.2.3 影响转化频率的因素 |
37-39 |
|
3.2.3.1 芽尖的继代培养时间对抗性芽尖频率的影响 |
37-38 |
|
3.2.3.2 浸染液浓度对抗性芽尖频率的影响 |
38-39 |
|
3.2.3.3 负压处理时间对抗性芽尖频率的影响 |
39 |
|
3.2.4 转基因植株的PCR和PCR-Southern杂交检测 |
39-40 |
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3.3 转基因植株及T_1代的耐盐性分析 |
40-45 |
|
3.3.1 转基因芽和转基因植株的耐盐性分析 |
40-42 |
|
3.3.2 转基因植株后代的PCR检测和耐盐性分析 |
42-45 |
|
3.3.2.1 转基因植株后代的PCR检测 |
42-43 |
|
3.3.2.2 转基因植株后代的耐盐性分析 |
43-45 |
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3.4 离体开花 |
45-48 |
|
3.4.1 影响离体开花的因素 |
46-48 |
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3.4.1.1 培养基激素组成及材料继代培养时间 |
46-47 |
|
3.4.1.2 基因型 |
47-48 |
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第四部分 讨论 |
48-51 |
|
4.1 黑麦草高效丛生芽发生的影响因素 |
48 |
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4.2 黑麦草离体开花的意义 |
48 |
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4.3 黑麦草高效丛生芽发生的意义 |
48-49 |
|
4.4 农杆菌介导的黑麦草遗传转化体系的优化 |
49-50 |
|
4.5 适宜的选择剂浓度的确定 |
50-51 |
|
参考文献 |
51-58 |
|
致谢 |
58-59 |
|
攻读学位期间发表的学术论文 |
59 |
|
| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.160138 |
