| 【中文题名】 | 黑麦草离体再生体系的建立和基因枪法介导的遗传转化研究 |
| 【英文题名】 | Establishment of High Frequency Regeneration System and Genetic Transformation by Particle Bombardment of Perennial Ryegrass |
| 【学科专业】 | 细胞生物学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2007-8-29 |
| 【中关键词】 | 多年生黑麦草,成熟胚,植株再生,bar基因,基因枪转化, |
| 【英关键词】 | perennial ryegrass,mature embryo,plant regeneration,bar gene,bombardment, |
| 【分类导航】 | 生物科学>植物学>植物细胞遗传学>>> |
| 【论文摘要】 |
黑麦草是禾本科黑麦草属植物，被广泛用作草坪草和牧草，利用基因工程技术对其进行遗传改良研究一直备受人们关注。本实验在建立高效的多年生黑麦草离体再生体系的基础上，通过基因枪法转移bar基因，获得了多年生黑麦草的转基因植株，为黑麦草品种的改良提供了新的途径。
一、黑麦草离体再生体系的建立
经过对比试验，以成熟胚为外植体，成功地建立了黑麦草的再生体系，筛选出适合于黑麦草成熟胚的再生培养基配方。实验结果显示愈伤组织诱导培养基以MS基本培养基+5mg/L 2,4-D为最佳，胚性愈伤组织诱导频率为23.8％；分化培养基为MS基本培养基+1mg/L 6-BA，分化频率可以达到33.3％。
二、多年生黑麦草遗传转化体系的建立
对愈伤组织进行除草剂Bialaphos敏感性试验，确定了筛选愈伤组织的最佳选择压为2mg／L，在此基础上建立了多年生黑麦草胚性愈伤组织的基因枪法遗传转化体系。实验过程中，首先在含有甘露醇和山梨醇各0.25mol／L的MS培养基上对生长旺盛的胚性愈伤组织进行5～12个小时的高渗处理，然后实施基因枪轰击。轰击时的真空度为28英寸汞柱，氦气气压为1350psi，每枪的金... |
| 【论文题纲】 |
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摘要 |
3-4 |
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Abstract |
4-8 |
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缩写表 |
8-10 |
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I 文献综述 |
10-29 |
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1. 草坪草离体再生体系的研究进展 |
11-15 |
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1.1 培养基 |
11 |
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1.2 草坪草再生体系的建立 |
11-15 |
|
1.2.1 胚性愈伤组织的诱导 |
11-12 |
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1.2.2 悬浮培养细胞 |
12-13 |
|
1.2.3 原生质体培养 |
13 |
|
1.2.4 花药培养 |
13-14 |
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1.2.5 茎尖培养 |
14-15 |
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2. 草坪草遗传转化的主要方法 |
15-20 |
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2.1 直接转化原生质体 |
15 |
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2.2 基因枪转化法 |
15-18 |
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2.3 农杆菌转化法 |
18-19 |
|
2.4 硅碳纤维介导法 |
19 |
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2.5 外源基因的表达调控 |
19-20 |
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3. 草坪草遗传转化中转基因细胞或植株的筛选和鉴定 |
20-22 |
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3.1 报告基因 |
20-21 |
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3.2 选择标记基因 |
21-22 |
|
3.3 转基因草坪草的分子生物学检测 |
22 |
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4. 转基因技术在草坪草品种改良中的应用 |
22-26 |
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4.1 利用转基因技术对草坪草非生物胁迫抗性的改良 |
22-24 |
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4.1.1 抗渗透胁迫 |
22-23 |
|
4.1.2 抗离子胁迫 |
23 |
|
4.1.3 抗氧化胁迫 |
23 |
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4.1.4 与非生物胁迫相关的转录因子 |
23-24 |
|
4.2 利用转基因技术对草坪草生物胁迫抗性的改良 |
24-25 |
|
4.2.1 对草坪草抗病性的改良 |
24 |
|
4.2.2 对草坪草抗虫性的改良 |
24-25 |
|
4.3 利用转基因技术对草坪草除草剂抗性的改良 |
25-26 |
|
5. 草坪草遗传转化中存在的主要问题和展望 |
26-27 |
|
6. 本实验的研究目的和意义 |
27-29 |
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II 材料与方法 |
29-39 |
|
1 黑麦草离体再生体系的建立 |
29-31 |
|
1.1 植物材料 |
29 |
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1.2 培养基 |
29 |
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1.3 黑麦草成熟胚离体再生体系的建立 |
29-30 |
|
1.3.1 黑麦草种子的消毒 |
29-30 |
|
1.3.2 胚性愈伤组织的诱导与继代 |
30 |
|
1.3.2.1 胚性愈伤组织的诱导 |
30 |
|
1.3.2.2 愈伤组织的继代 |
30 |
|
1.3.3 植株的再生 |
30 |
|
1.3.4 炼苗和移栽 |
30 |
|
1.4 除草剂梯度实验 |
30-31 |
|
1.5 数据统计 |
31 |
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2. 基因枪法转化黑麦草的研究 |
31-36 |
|
2.1 植物材料 |
31 |
|
2.2 质粒的构建、提取 |
31-34 |
|
2.2.1 质粒的构造 |
31-33 |
|
2.2.2 质粒的提取 |
33-34 |
|
2.2.3 质粒的电泳检测及浓度测定 |
34 |
|
2.3 金粉的制备 |
34 |
|
2.4 材料的渗透处理和微弹轰击 |
34-36 |
|
2.4.1 材料的渗透处理 |
34 |
|
2.4.2 微弹的包被 |
34-35 |
|
2.4.3 愈伤组织的基因枪轰击过程 |
35-36 |
|
2.5 转化体的筛选和植株的再生 |
36 |
|
3. β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)基因表达分析 |
36-37 |
|
3.1 β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)基因的瞬时表达分析 |
36 |
|
3.2 β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)基因在转化植株中的表达分析 |
36-37 |
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4. 再生植株的分子鉴定 |
37-39 |
|
4.1 黑麦草基因组DNA的提取 |
37 |
|
4.2 再生植株的PCR检测 |
37-39 |
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III 结果与分析 |
39-46 |
|
1. 黑麦草离体再生体系的建立 |
39-43 |
|
1.1 不同2，4-D浓度对愈伤组织形成的影响 |
39-41 |
|
1.2 不同6-BA浓度对愈伤组织分化的影响 |
41-42 |
|
1.3 再生植株的生根和移栽 |
42 |
|
1.4 筛选剂浓度测定实验 |
42-43 |
|
2. 用基因枪法转化黑麦草的研究 |
43-46 |
|
2.1 不同微弹用量和轰击次数对gus基因瞬间表达的影响 |
43-44 |
|
2.2 黑麦草转基因植株的PCR检测 |
44-45 |
|
2.3 转基因黑麦草的植株中β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)基因的表达分析 |
45 |
|
2.4 基因枪轰击的次数及结果 |
45 |
|
2.5 除草剂涂抹转化植株实验 |
45-46 |
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IV 分析与讨论 |
46-49 |
|
1. 黑麦草离体再生体系的建立 |
46 |
|
2. 用基因枪法将bar基因导入黑麦草中的研究 |
46-49 |
|
参考文献 |
49-59 |
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附录 |
59-61 |
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图版说明 |
61-64 |
|
图版I |
62-63 |
|
图版II |
63-64 |
|
致谢 |
64 |
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| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.160533 |
