| 【中文题名】 | 根癌农杆菌介导的抗寒基因转录因子CBF转化苹果的研究 |
| 【英文题名】 | Studies on Transcription Factor CBF Gene Transformation Via Agrobacterium Tumefaciens in Apple (Malus Domestica Borkh) |
| 【学科专业】 | 果树学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2006-7-13 |
| 【中关键词】 | 苹果,转录因子CBF基因,再生,根癌农杆菌遗传转化,PCR,脯氨酸 |
| 【英关键词】 | Apple,Transcription factor CBF gene,Regeneration,Agrobacterium-mediated transformation,PCR,Proline, |
| 【分类导航】 | 农业科学>园艺>果树园艺>仁果类>苹果> |
| 【论文摘要】 | 本研究以苹果(Malus domestica Borkh)营养系砧木M_(26)和栽培品种嘎拉试管苗为试验材料,以农杆菌EHA105为媒介把目的基因——抗寒基因的转录因子CBF导入苹果。通过对影响叶片、白化茎段离体再生不定芽和根癌农杆菌(Agrobacterium)EHA105介导的遗传转化效率的若干因素的研究,优化了苹果再生不定芽系统和遗传转化系统,并成功将CBF基因导入到了苹果的基因组中。
主要研究结果如下:
1.苹果不同外植体再生不定芽能力不同,以白化茎段的再生效果优于叶片。适宜苹果白化茎段不定芽再生的体系为:继代苗暗培养20天左右获得白化茎段,取1～2节位的白化茎段切成0.5cm的小段,接种(平放)在MS培养基上,暗培养2～3周就会有芽点出现。M_(26)和Gala的不定芽再生效率均达到95%以上。
2.培养基中添加适宜浓度的BA(5.0mg/L)和TDZ(1.0mg/L) 可使M_(26)白化茎段不定芽再生达到较高的水平,但TDZ的使用会增加再生芽的玻璃化现象,以5.0mg/L的BA用于M_(26)白化茎段不定芽再生较为适宜。
3.白化茎段的褐化现象比叶片严重,在再生培养基中... |
| 【论文题纲】 |
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1 引言 |
11-17 |
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1.1 课题提出的目的和意义 |
11 |
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1.2 植物寒害机理研究 |
11-14 |
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1.2.1 冷害引起细胞生理生化及结构的改变 |
12 |
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1.2.2 膜的相变 |
12 |
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1.2.3 蛋白质解联和变性 |
12-13 |
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1.2.4 活性氧的破坏作用 |
13 |
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1.2.5 钙离子(Ca~(2+))是冷敏感植物对冷胁迫的“最先感应体”和“伤害的引发物” |
13-14 |
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1.3 植物抗寒基因工程研究进展 |
14-17 |
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1.3.1 与抗寒有关的基因的研究 |
14 |
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1.3.2 CBF转录因子及其在植物抗寒中的作用 |
14-15 |
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1.3.3 CBF基因转化植物的研究进展 |
15-17 |
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2 材料与方法 |
17-24 |
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2.1 试验材料 |
17 |
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2.1.1 植物材料 |
17 |
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2.1.2 农杆菌菌株及载体 |
17 |
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2.2 试验设计与方法 |
17-24 |
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2.2.1 本试验所用的培养基 |
17 |
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2.2.2 苹果对卡那霉素和头孢霉素的敏感性试验 |
17-18 |
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2.2.3 TDZ与BA对苹果外植体再生效率的比较 |
18 |
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2.2.4 白化茎段与叶片再生效率的比较 |
18 |
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2.2.5 Vc和AgNO_3对白化茎段再生效率的影响 |
18 |
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2.2.6 菌液浓度对转化效率的影响 |
18 |
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2.2.7 预培养时间对苹果转化率的影响 |
18-19 |
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2.2.8 侵染时间对苹果转化率的影响 |
19 |
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2.2.9 共培养时间对转化效率的影响 |
19 |
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2.2.10 苹果基因转化过程中乙酰丁香酮的加入对转化率的影响 |
19 |
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2.2.11 侵染液中添加生长调节剂对苹果转化率的影响 |
19 |
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2.2.12 侵染液中添加表面活性剂对苹果转化率的影响 |
19 |
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2.2.13 苹果基因转化方法 |
19-20 |
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2.2.14 Km抗性分析 |
20 |
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2.2.15 PCR检测方法 |
20-22 |
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2.2.16 脯氨酸含量的测定 |
22 |
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2.2.17 生根移栽 |
22 |
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2.2.18 结果观测与统计方法 |
22-24 |
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3 结果与分析 |
24-37 |
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3.1 抗生素的敏感性试验 |
24-26 |
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3.1.1 Km对M_(26)叶片、白化茎段不定芽再生的影响 |
24 |
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3.1.2 Km对M_(26)、嘎拉继代苗的影响 |
24-25 |
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3.1.3 头孢霉素(Cef)对农杆菌生长和M_(26)叶片、白化茎段再生不定芽的影响 |
25-26 |
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3.2 提高苹果外植体的再生效率 |
26-29 |
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3.2.1 TDZ与BA对苹果白化茎段再生效果的比较 |
26-27 |
|
3.2.2 白化茎段与叶片再生效率的比较 |
27 |
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3.2.3 继代苗苗龄对苹果白化茎段再生效率的影响 |
27-28 |
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3.2.4 抗坏血酸(Vc)对白化茎段再生效率的影响 |
28-29 |
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3.2.5 AgNO_3对白化茎段不定芽再生效率的影响 |
29 |
|
3.3 提高苹果外植体的转化率 |
29-35 |
|
3.3.1 预培养时间对苹果转化率的影响 |
29-30 |
|
3.3.2 菌液浓度对苹果转化率的影响 |
30-31 |
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3.3.3 侵染时间对苹果转化率的影响 |
31 |
|
3.3.4 共培养时间对苹果转化率的影响 |
31-32 |
|
3.3.5 继代苗龄对苹果白化茎段转化效率的影响 |
32 |
|
3.3.6 乙酰丁香酮(AS)对苹果转化效率的影响 |
32-34 |
|
3.3.7 培养基中蔗糖浓度对转化率的影响 |
34 |
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3.3.8 侵染液中添加表面活性剂Tween80对苹果转化率的影响 |
34-35 |
|
3.3.9 侵染液中添加生长调节剂对苹果转化率的影响 |
35 |
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3.4 苹果基因转化的检测 |
35-37 |
|
3.4.1 Km抗性检测 |
35-36 |
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3.4.2 PCR电泳检测 |
36 |
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3.4.3 转化株系脯氨酸含量的测定 |
36-37 |
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4 讨论 |
37-42 |
|
4.1 苹果基因转移受体系统的优化 |
37-38 |
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4.1.1 白化茎段再生不定芽的影响冈素及调控 |
37-38 |
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4.1.2 关于苹果白化茎段再生过程中的褐化问题 |
38 |
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4.1.3 AgNO_3对苹果白化茎段再生的影响 |
38 |
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4.2 苹果高效转化体系的优化 |
38-41 |
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4.2.1 植物材料基因型、生理状态对遗传转化的影响 |
38-39 |
|
4.2.2 预培养时间对转化的影响 |
39 |
|
4.2.3 菌液浓度和共培养时间对转化率的影响 |
39-40 |
|
4.2.4 有关AS与Vir基因的诱导 |
40-41 |
|
4.3 转录因子CBF与苹果的抗寒性改良 |
41-42 |
|
5.结论 |
42-43 |
|
参考文献 |
43-48 |
|
附录 |
48-51 |
|
作者简介 |
51-52 |
|
致谢 |
52-53 |
|
华北农学报 |
53-58 |
|
| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.159361 |
