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抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶融合蛋白基因的设计、克隆及在大肠杆菌中的表达

作者：冯瑄 Publish: 2005-11-18 Hits:-

【中文题名】

抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶融合蛋白基因的设计、克隆及在大肠杆菌中的表达

【英文题名】

The Design, Cloning and Expression in E.coli of a Novel Fusion Protein Cecropin B-Human Lysozyme Gene

【学科专业】

中药学

【论文级别】

硕士论文

【投稿时间】

2005-11-18

【中关键词】

抗菌肽,天蚕素B,人溶菌酶,基因克隆,融合蛋白,

【英关键词】

Antibacterial peptide,Cecropin B,Human Lysozyme,Gene cloning,Fusion protein,

【分类导航】

医药、卫生>基础医学>医学免疫学>>>

【论文摘要】

抗菌肽(anti-bacterial peptides,简称ABP)是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽,是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障,其生成和释放是机体炎症反应的组成部分。抗菌肽不仅对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌具有高效广谱的杀灭能力,而且对某些病毒、真菌和原虫也具有抑杀作用;同时它对一些肿瘤细胞具有选择性杀伤作用,但对正常哺乳动物和昆虫细胞却无明显的毒副作用。人溶菌酶(human lysozyme)具有抗革兰氏阴性细菌和抗一些病毒的能力。人溶菌酶是人体内的一种蛋白质,和人体具有天然相容性。在临床上应用时,比其它溶菌酶更安全,没有刺激性和副作用。本实验目的是想通过基因重组,以融合的形式将Cecropin B和人溶菌酶基因连接至高效的大肠杆菌表达载体上并进行表达,进一步探讨融合蛋白的抗菌和抗病毒活性,以期研制出具有更高活性的抗菌和抗病毒重组蛋白。为了构建抗菌肽B(Cecropin B)和人溶菌酶(hLyso)的基因克隆载体,通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽B基因,从pUC118-hLvso上卸下人溶菌酶基因,然后按照正确的阅读框架融合并重组至克隆载体中。通过对重组质粒的测序,表明...

【论文题纲】

第一部分文献综述	9-22
1．抗菌肽的研究进展	9-17
1．1 抗菌肽的发现	9
1．2 抗菌肽的分类及理化性质	9-11
1．3 抗菌肽的作用机制	11-15
1．4 抗菌肽的药理作用及应用前景	15-16
1．5 Cecropin类抗菌肽	16-17
2．人源溶菌酶的研究进展	17-18
2．1 人源溶菌酶的理化性质	17
2．2 人源溶菌酶的药理作用及应用前景	17-18
3．抗菌肽基因工程研究进展	18-19
3．1 抗菌肽克隆基因的表达	18
3．2 人工合成抗菌肽基因和融合肽基因的表达	18-19
4．实验的意义和研究内容	19-22
第二部分材料和方法	22-39
1．主要试剂与仪器	22-23
1．1 基本试剂及生产厂家	22
1．2 酶和其它试剂	22
1．3 本实验所用的菌株及质粒	22
1．4 主要仪器和厂家	22-23
1．5 试剂和培养基	23
2．实验方法	23-39
2．1 融合基因序列设计与合成	23-25
2．2 抗菌肽Cecropin B的基因序列设计与合成	25-28
2．3 人源溶菌酶的基因的获得	28-29
2．4 抗菌肽Cecropin B基因和人源溶菌酶基因的酶切反应	29
2．5 PCR产物的纯化及回收	29-31
2．6 目的片断与测序载体pBS-T的酶连	31-32
2．7 连接产物的转化及鉴定	32-34
2．8 融合基因Cecropin B-hLy与表达载体pET32a的连接	34-35
2．9 重组质粒pET32a-CB-hLy的转化与鉴定	35
2．10 重组菌株的诱导表达试验	35-36
2．11 融合蛋白Cecropin B-hLysozyme的分析	36-38
2．12 融合蛋白活性测定	38-39
第三部分结果与分析	39-47
3．1 融合基因Cecropin B-hLysozyme测序载体的构建	39-42
3．1．1 重叠区合成Cecropin B基因及PCR扩增hLysozyme基因结果	39
3．1．2 克隆载体的构建与鉴定	39-40
3．1．3 测序结果	40-42
3．2 融合基因Cecropin B-hLysozyme表达载体的构建	42-44
3．2．1 重组质粒pET32a-CB-hLy的构建及酶切鉴定	42-43
3．2．2 重组质粒pET32a-CB-hLy的测序结果	43-44
3．3 融合基因Cecropin B-hLysozyme在大肠杆菌中的表达	44-45
3．3．1 在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达	44
3．3．2 在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中的表达	44-45
3．4 融合蛋白Cecropin B-hLysozyme的分析	45-47
3．4．1 亲和层析IDA-Cu	45-46
3．4．2 凝胶排阻脱盐柱层析G-25	46
3．4．3 活性测定	46-47
第四部分讨论	47-49
1．融合基因Cecropin B-hLysozyme的人工合成	47
2．表达系统中的问题	47-48
3．需要进一步研究的问题	48-49
第五部分结论	49-50
第六部分参考文献	50-56
致谢	56

【DOI】

LunWen.ID:2.2008.174419



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