| 【中文题名】 | 应用RNA干涉技术阻断EBV潜伏期基因LMP1表达的实验研究 |
| 【英文题名】 | RNA Interference for Inhibition of EBV Latent Membrane Gene LMP1 Expression |
| 【学科专业】 | 病原生物学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2006-7-26 |
| 【中关键词】 | 小发夹RNA,潜伏膜蛋白基因1,PA317,pSUPER.retro,RNAi逆转录病毒载体,EBV |
| 【英关键词】 | shRNA,LMP1,PA317,retroviral vector,EBV, |
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| 【论文摘要】 | 目的 构建携带针对EBV潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER.retro.neo gfp RNAi逆转录病毒载体,并筛选出稳定产毒的细胞克隆,探讨LMP1特异性沉默对EBV阳性细胞凋亡的影响。
方法 采用DNA重组技术将60nt能转录产生靶向LMP1小发夹RNA(small hairpin RNA, shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER.retro.neo gfp,并用限制性内切酶酶切鉴定以及测序鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317,G418筛选获得稳定产生逆转录病毒的细胞克隆;收集病毒上清,感染靶细胞Raji;采用RT-PCR检测靶基因LMP1的沉默效果,流式细胞术检测Raji细胞的凋亡。
结果 ①酶切鉴定及测序鉴定结果表明插入片段的序列和方向完全正确;② 重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆;③RT-PCR结果表明pSUPER.retro.neo gfp RNAi逆转录病毒可有效抑制Raji细胞中LMP1的表达,流式细胞仪检测表明LMP1沉默可导致Raji细胞凋亡,同时用细胞凋亡诱导剂TGF-β1... |
| 【论文题纲】 |
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引言 |
5 |
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第一章 材料与方法 |
5-17 |
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1. 仪器、试剂和耗材 |
5-7 |
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2. 载体的选择 |
7-8 |
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3. 由DNA转录生成siRNA的策略 |
8-9 |
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4. 靶向寡核苷酸的设计 |
9-11 |
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5. 寡核苷酸与pSUPER载体的连接 |
11 |
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6. 连接产物的转化 |
11-12 |
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7. 重组质粒的筛选及鉴定 |
12-13 |
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8. 转染包装细胞系PA317 |
13-14 |
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9. 病毒滴度的测定 |
14 |
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10. 感染靶细胞Raji并提取细胞RNA |
14-15 |
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11. RNAi效应的检测 |
15-17 |
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第二章 结果 |
17-22 |
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1. pSUPER.retro.neo+gfp质粒酶切后电泳结果 |
17 |
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2. 重组质粒的酶切鉴定 |
17-18 |
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3. 靶序列鉴定 |
18-19 |
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4. 逆转录病毒载体的包装 |
19-20 |
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5. 逆转录病毒滴度测定 |
20 |
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6. 感染靶细胞Raji，特异性沉默靶基因LMP1 |
20-21 |
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7. PI单染色法流式细胞术检测LMP1 siRNA诱导Raji细胞凋亡 |
21-22 |
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第三章 讨论 |
22-29 |
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第四章 结论 |
29-30 |
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参考文献 |
30-34 |
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综述 |
34-54 |
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参考文献 |
48-54 |
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攻读学位期间的研究成果 |
54-55 |
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致谢 |
55-56 |
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学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 |
56-72 |
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| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.174854 |
