| 【中文题名】 | 人血小板生成素重组细胞的培养工艺研究 |
| 【英文题名】 | |
| 【学科专业】 | 微生物与生化药学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2001-11-21 |
| 【中关键词】 | 血小板生成素,重组基因表达,生物反应器,纯化,, |
| 【英关键词】 | Thrombopoietin, Expression of cloned gene, Bioreactor, Purification, |
| 【分类导航】 | 医药、卫生>药学>药物基础科学>药物生物学>> |
| 【论文摘要】 |
本研究的内容主要是建立高密度、高表达培养TPO重组细胞的工艺。进
行了包括构建重组细胞株、确立重组细胞培养方法、建立TPO体外活性测定
方法、纯化和鉴定表达产物等一系列实验。
首先将带有二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的TPO表达质粒pTcho以电
穿孔法转入二氢叶酸还原酶缺陷的CHO（DHFR）细胞，通过条件培养基选
择及氨甲碟呤加压筛选，获得能够高效、稳定地表达rhTPO的细胞株，命名
为STPO-1。经细胞稳定性等多项指标的鉴定，证实该细胞可以作为生产细胞
株。
为了实现高表达细胞培养，通过实验选择了合适的培养基、pH值和表达
刺激物质等，确定了STPO-1细胞在瓶中的培养及表达方法。使细胞在瓶培养
时的TPO表达量达到2000U/ml（相当于7mg/ml）。为了进一步实现重组细
胞的高密度培养，利用生物反应器进行了大规模连续培养，摸索出了STPO-1
细胞在生物反应器中培养时合适的pH值、溶解氧值、转数、通气流量、葡萄
糖浓度和流加速度等，确定了STPO-1细胞在生物反应器中的生长及表达条件，
... |
| 【论文题纲】 |
|
中文摘要 |
9-11 |
|
英文摘要 |
11-13 |
|
前言 |
13-21 |
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实验材料 |
21-26 |
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一、 主要仪器 |
21-22 |
|
二、 质粒和细胞 |
22 |
|
三、 试剂 |
22 |
|
四、 溶液 |
22-24 |
|
五、 培养基和胰酶 |
24-25 |
|
六、 柱填料 |
25 |
|
七、 实验动物 |
25-26 |
|
实验方法 |
26-36 |
|
一、 表达细胞株的构建 |
26-27 |
|
1． 宿主细胞培养 |
26 |
|
2． 表达载体转染宿主细胞 |
26-27 |
|
二、 筛选表达细胞株 |
27 |
|
1． 初级筛选 |
27 |
|
2． 复筛（扩大表达量） |
27 |
|
三、 克隆细胞株的鉴定 |
27-30 |
|
1． Northern Blot分析 |
27-28 |
|
2． 重组细胞表达量的测定 |
28 |
|
3． TPO基因拷贝数分析 |
28-29 |
|
4． 重组细胞外源因子检测 |
29 |
|
5． 重组细胞核型分析 |
29-30 |
|
6． 重组细胞致瘤性测定 |
30 |
|
四、 TPO生物活性测定 |
30-31 |
|
1． 体外生物活性测定 |
30-31 |
|
2． 体内生物活性测定 |
31 |
|
五、 细胞培养 |
31-32 |
|
1． 细胞瓶培养 |
31 |
|
2． 细胞冻存 |
31 |
|
3． 细胞复苏 |
31 |
|
4． 细胞罐培养 |
31-32 |
|
5． 葡萄糖含量测定 |
32 |
|
六、 产物纯化 |
32-34 |
|
1． 超滤 |
32 |
|
2． 染料亲和层析 |
32-33 |
|
3． 植物凝集素亲和层析 |
33 |
|
4． 凝胶层析（G-25） |
33 |
|
5． 离子交换层析 |
33 |
|
6． 反相高效液相层析 |
33 |
|
7． 疏水层析 |
33 |
|
8． 凝胶层析（S-200） |
33-34 |
|
七、 产品鉴定 |
34-36 |
|
1． 电泳和免疫印记分析 |
34 |
|
2． HPLC分析 |
34 |
|
3． 肽图分析 |
34 |
|
4． 等电点分析 |
34 |
|
5． 糖和唾液酸分析 |
34-36 |
|
实验结果 |
36-62 |
|
一、 TPO表达细胞株的构建和筛选 |
36-40 |
|
二、 TPO活性检测方法的建立 |
40-43 |
|
1． 体外生物活性测定 |
40-43 |
|
2． 体内生物活性测定 |
43 |
|
三、 重组细胞株的鉴定 |
43-48 |
|
1． 重组细胞培养条件的确定 |
43-44 |
|
2． 重组细胞中目的基因的确定 |
44 |
|
3． 重组细胞中基因拷贝数的测定 |
44-46 |
|
4． 重组细胞表达稳定性研究 |
46-47 |
|
5． 重组细胞形态检查 |
47 |
|
6． 重组细胞外源因子检查 |
47 |
|
7． 重组细胞致瘤性检查 |
47-48 |
|
8． 重组细胞核型检查 |
48 |
|
四、 重组细胞表达TPO条件的确定 |
48-50 |
|
五、 重组细胞的细胞罐培养和表达 |
50-54 |
|
六、 表达产物的纯化 |
54-59 |
|
七、 表达产物的鉴定 |
59-62 |
|
1． 生物活性 |
59 |
|
2． 电泳及免疫印记分析 |
59 |
|
3． HPLC分析纯度 |
59-60 |
|
4． N端氨基酸序列测定 |
60 |
|
5． 肽图分析 |
60 |
|
6． 质谱分析 |
60 |
|
7． 等电点分析 |
60 |
|
8． 糖含量和唾液酸含量分析 |
60-62 |
|
结论 |
62-63 |
|
讨论 |
63-66 |
|
参考文献 |
66-69 |
|
致谢 |
69 |
|
| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.34836 |
