| 【中文题名】 | 迟缓爱德华菌溶血活化基因（eha）功能的研究 |
| 【英文题名】 | Study on Haemolysin Activator Gene (eha) in Edwardsiella Tarda |
| 【学科专业】 | 食品科学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2007-10-9 |
| 【中关键词】 | 迟缓爱德华菌,eha,溶血素,基因表达,基因调控,基因缺失 |
| 【英关键词】 | Edwardsiella tarda,eha,hemolysin,gene expression,gene regulation,gene deletion, |
| 【分类导航】 | 农业科学>水产、渔业>水产保护学>鱼病学>> |
| 【论文摘要】 |
目的：迟缓爱德华菌(Edwardsiella trada，简称Et)是在水产养殖中重要的病原菌，能引起多种水产养殖动物，如鱼类、鳗鱼、龟鳖、牛蛙等的疾病。迟缓爱德华菌还是一种人畜共患病的病原菌，是爱德华菌属中唯一感染人的成员。预防和治疗水产养殖动物迟缓爱德华菌感染主要使用抗生素，这涉及到食品的安全问题。接种疫苗作为一种安全可靠的预防手段，已得到大家的公认，但目前尚无有效疫苗的应用。尽管已发现Et的一些重要的致病因子，如溶血素、载铁体、肠毒素等，但其致病机理仍不明确。因此，对迟缓爱德华菌的毒力因子及其调控的进一步研究，有助于发现新的致病机制和疫苗靶点。本实验旨在研究Et溶血素活化基因(Et haemolysin activator gene，eha)的生物学特性和调控作用，并构建其缺失株。
方法：构建重组载体pET28a~+-eha，转化大肠埃希菌BL21，利用IPTG诱导大肠埃希菌表达EHA蛋白，菌体超声裂解物经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，检测其纯化蛋白溶血活性及Vero细胞毒性。将eha重组质粒pED101和载体pACYC184分别转入大肠埃希菌DH5α中，利用RT-PCR及SDS-PA... |
| 【论文题纲】 |
|
摘要 |
5-7 |
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ABSTRACT |
7-11 |
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引言 |
11-13 |
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第一章 迟缓爱德华菌的生物学特性与致病性(文献综述) |
13-21 |
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1.1 爱德华菌的生物学特性 |
13-15 |
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1.1.1 分类 |
13-14 |
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1.1.2 生物学特性 |
14-15 |
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1.1.3 迟缓爱德华菌的分型 |
15 |
|
1.2 迟缓爱德华菌的致病性 |
15-19 |
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1.2.1 溶血素 |
15-17 |
|
1.2.2 铁载体和刚果红结合试验 |
17 |
|
1.2.3 侵袭性和抗吞噬性 |
17-18 |
|
1.2.4 甘露糖抗性凝集素和其他一些毒力因子 |
18-19 |
|
1.3 微生物学检查 |
19-21 |
|
1.3.1 形态特征检查 |
19 |
|
1.3.2 生化特性检查 |
19 |
|
1.3.3 分子生物学及免疫检查方法 |
19-20 |
|
1.3.4 致病性迟缓爱德华菌的检验 |
20-21 |
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第二章 迟缓爱德华菌溶血活化基因eha对大肠埃希氏菌溶血基因clyA的调控 |
21-29 |
|
2.1 材料与方法 |
21-25 |
|
2.1.1 菌株与质粒 |
21-22 |
|
2.1.2 培养基和抗生素 |
22 |
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2.1.3 酶和试剂及主要仪器型号 |
22 |
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2.1.4 pED101质粒的构建 |
22-23 |
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2.1.5 溶血现象的观察 |
23 |
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2.1.6 RT-PCR |
23-24 |
|
2.1.7 SDS-PAGE电泳 |
24-25 |
|
2.2 结果 |
25-27 |
|
2.2.1 溶血现象 |
25 |
|
2.2.2 RT-PCR结果 |
25-26 |
|
2.2.3 SDS-PAGE电泳结果 |
26-27 |
|
2.3 讨论 |
27-29 |
|
第三章 迟缓爱德华菌溶血活化基因eha的表达，蛋白纯化及生物学活性 |
29-47 |
|
3.1 材料和方法 |
29-38 |
|
3.1.1 菌株与质粒 |
29 |
|
3.1.2 培养基和抗生素 |
29-30 |
|
3.1.3 酶和试剂及主要仪器型号 |
30 |
|
3.1.4 构建eha重组表达载体pEHA1 |
30-36 |
|
3.1.5 pEHA1在大肠埃希菌 BL21中的诱导表达 |
36-37 |
|
3.1.6 eha蛋白的纯化 |
37 |
|
3.1.7 eha蛋白的生物学活性检测 |
37-38 |
|
3.2 结果 |
38-45 |
|
3.2.1 PCR扩增eha片段 |
38 |
|
3.2.2 阳性克隆的筛选及鉴定 |
38-41 |
|
3.2.3 pEHA1克隆子在2%的绵羊血平板上的溶血情况 |
41 |
|
3.2.4 用 IPTG诱导eha的表达 |
41-42 |
|
3.2.5 eha蛋白的纯化 |
42-43 |
|
3.2.6 eha蛋白的溶血活性 |
43 |
|
3.2.7 eha蛋白的Vero细胞毒性 |
43-45 |
|
3.3 讨论 |
45-47 |
|
第四章 迟缓爱德华菌溶血活化基因eha缺失株的构建 |
47-54 |
|
4.1 材料与方法 |
47-50 |
|
4.1.1 菌株与质粒 |
47 |
|
4.1.2 PCR引物设计 |
47-48 |
|
4.1.3 PCR扩增e1和e2片段 |
48 |
|
4.1.4 连接e1和e2片段 |
48 |
|
4.1.5 大量扩增e1-e2片段 |
48 |
|
4.1.6 pEH101的构建 |
48-49 |
|
4.1.7 电转入ET-89602 |
49 |
|
4.1.8 第一次同源重组子的鉴定 |
49 |
|
4.1.9 同源重组缺失株的富集 |
49-50 |
|
4.1.10 同源重组缺失株的PCR验证 |
50 |
|
4.2 结果 |
50-52 |
|
4.2.1 e1-e2片段的连接 |
50-51 |
|
4.2.2 质粒pEH101的构建 |
51 |
|
4.2.3 第一次同源重组子的鉴定 |
51-52 |
|
4.2.4 同源重组缺失株的富集及验证 |
52 |
|
4.3 讨论 |
52-54 |
|
主要结论 |
54-55 |
|
参考文献 |
55-61 |
|
致谢 |
61-62 |
|
攻读硕士学位期间发表的论文 |
62 |
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| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.165553 |
