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肝素寡糖的制备、结构分析及其抗哮喘分子作用机制研究

作者：陈亮珍 Publish: 2005-10-17 Hits:-

【中文题名】

肝素寡糖的制备、结构分析及其抗哮喘分子作用机制研究

【英文题名】

Heparin-Derived Oligosaccharides Preparation, Structure Analysis and Their Anti-Asthma Molecular Action Mechanisms

【学科专业】

微生物与生化药学

【论文级别】

硕士论文

【投稿时间】

2005-10-17

【中关键词】

肝素寡糖,结构,哮喘,白细胞介素-4,白细胞介素-5,免疫球蛋白E

【英关键词】

Heparin-derived oligosaccharide,Structure,Asthma,IL-4,IL-5,IgE,CD23,NF-κB,ATR-FTIR,

【分类导航】

医药、卫生>药学>药剂学>制剂学>>

【论文摘要】

肝素(Heparin)属于糖胺聚糖类化合物,分子中主要由糖醛酸(艾杜糖醛酸和葡糖醛酸)和葡糖胺以及它们的硫酸化和乙酰化的衍生物以1→4糖苷键连接而成的直链多糖链化合物,M_r分布范围3kD～30kD。肝素寡糖是采用不同降解方法降解肝素获得的平均M_r在1kD～4kD的寡糖片段。不同降解方法所得肝素寡糖具有不同的结构,从而具有不同的生物学活性。研究发现肝素除了具有抗血栓和抗凝血活性外,还具有抑制平滑肌增生、抗炎症、抗肿瘤等生物学功能。哮喘是一种多炎症细胞、介质和细胞因子参与的慢性炎症性气道疾病,伴有气道高反应性和气道阻塞症状。白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)和白细胞介素-5(Interleukin-5,IL-5)是哮喘炎症过程发生的重要因子。哮喘病的一个重要特征就是IgE的增高,IgE能结合炎症细胞,在过敏原诱导下这些炎症细胞释放炎症介质,从而增强气道高反应性。炎症过程中的信号转导是炎症发生的重要途径,核转录因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)能调控炎性蛋白的合成,参与哮喘的炎症反应。本课题探讨了不同结构的肝素寡糖对哮喘炎症...

【论文题纲】

摘要	10-14
ABSTRACT	14-19
符号说明	19-21
第一章前言	21-32
1 哮喘病理机制	22-26
1．1 Th1/Th2失衡	22-23
1．2 IL-4与哮喘	23-24
1．3 IL-5与哮喘	24-25
1．4 IgE与哮喘	25
1．5 CD23与哮喘	25-26
1．6 NF-κB与哮喘	26
2 肝素与哮喘的防治	26-30
2．1 肝素与 IL-4	27-28
2．2 肝素与 IL-5	28-29
2．3 肝素与 IgD	29
2．4 肝素与 NF-κB	29-30
3 本课题已有的研究基础	30
4 本课题拟解决的问题	30-32
第二章肝素寡糖的分离、纯化与筛选	32-47
1 材料	32
1．1 材料和试剂	32
1．2 仪器	32
2 方法	32-34
2．1 肝素寡糖的分离、纯化	32-33
2．1．1 Superdex 30凝胶柱层析分离肝素寡糖	32-33
2．1．2 QFF离子交换色谱分离肝素寡糖	33
2．1．3 Spherisorb SAX离子交换色谱分离肝素寡糖	33
2．2 PAGE筛选肝素寡糖	33-34
2．2．1 缓冲液的配制	33-34
2．2．2 制胶	34
2．2．3 电泳	34
2．2．4 染色与脱色	34
3 结果	34-45
3．1 肝素寡糖分离纯化的结果	34-41
3．1．1 Superdex 30分离肝素寡糖的结果	34-36
3．1．2 Superdex 30二次分离肝素寡糖的结果	36-37
3．1．3 QFF分离肝素寡糖的结果	37-39
3．1．4 Spherisorb SAX分离肝素寡糖的结果	39-41
3．2 肝素寡糖样品的电泳结果	41-45
3．2．1 三种方法降解所得Olig及凝胶分离后的 PAGE电泳结果	41-42
3．2．2 亚硝酸降解肝素寡糖样品的 PAGE结果	42-43
3．2．3 过氧化氢降解肝素寡糖样品的PAGE结果	43
3．2．4 β-消除降解肝素寡糖样品的PAGE结果	43-45
4 讨论	45-46
5 小结	46-47
第三章肝素寡糖的结构研究	47-57
1 材料	47
1．1 材料与试剂	47
1．2 仪器	47
2 方法	47-49
2．1 肝素寡糖的红外光谱测定	47-48
2．2 肝素寡糖核磁共振图谱测定	48
2．3 双糖分析	48-49
2．3．1 裂解酶的处理	48
2．3．2 样品的消化	48
2．3．3 HPLC分析	48-49
3 结果	49-55
3．1 肝素寡糖红外光谱测定结果	49
3．2 肝素寡糖核磁共振图谱分析结果	49-52
3．2．1 肝素寡糖~1H-NMR分析结果	50
3．2．2 肝素寡糖~(13)C-NMR分析结果	50-52
3．3 双糖分析结果	52-55
3．3．1 标准品混合物	52
3．3．2 肝素寡糖双糖分析结果	52-55
4 讨论	55-56
5 小结	56-57
第四章肝素寡糖对mIL-4和mIL-5分泌的影响	57-71
1 材料	57
1．1 试剂	57
1．2 仪器	57
2 方法	57-60
2．1 小鼠哮喘模型的建立	57-58
2．1．1 实验动物	57
2．1．2 实验动物分组	57-58
2．1．3 小鼠哮喘模型的复制	58
2．2 观察肺组织形态学改变	58
2．3 小鼠脾淋巴细胞悬液的制备和培养	58-59
2．4 细胞因子的测定	59-60
2．4．1 mIL-4含量测定	59
2．4．2 mIL-5含量测定	59-60
2．5 统计学方法	60
3 结果	60-68
3．1 病理	60-62
3．2 小鼠脾淋巴细胞培养液mIL-4含量	62-64
3．2．1 mIL-4标准曲线的测定	62-63
3．2．2 mIL-4的表达水平	63-64
3．3 小鼠脾淋巴细胞培养上清液中mIL-5含量测定	64-66
3．3．1 mIL-5标准曲线的测定	64-65
3．3．2 mIL-5的表达水平	65-66
3．4 不同肝素寡糖浓度对mIL-4、mIL-5含量的影响	66-68
3．4．1 三种肝素寡糖对mIL-4含量影响测定	66-67
3．4．2 三种肝素寡糖对mIL-5含量影响测定	67-68
4 讨论	68-70
5 小结	70-71
第五章肝素寡糖对哮喘相关炎症因子表达的影响	71-86
1 材料	71
1．1 样品和试剂	71
1．2 仪器	71
2 方法	71-75
2．1 小鼠哮喘模型的建立	71-72
2．1．1 实验动物	71
2．1．2 实验动物分组	71-72
2．1．3 小鼠哮喘模型的复制	72
2．1．4 观察肺组织形态学改变	72
2．2 脾淋巴细胞悬液的制备和培养	72
2．3 哮喘炎症因子活性的测定	72-75
2．3．1 脾淋巴细胞培养上清液中mouse IgE含量测定	72-73
2．3．2 小鼠脾淋巴细胞 CD23阳性率流式测定	73-74
2．3．3 小鼠肺组织 NF-κB p65阳性率测定	74-75
3 结果	75-83
3．1 小鼠脾淋巴细胞悬液 IgE测定结果	75-77
3．1．1 标准曲线的测定	75
3．1．2 小鼠脾淋巴细胞悬液 IgE表达水平	75-77
3．2 小鼠脾淋巴细胞 CD23阳性率测定结果	77-80
3．2．1 CD23在脾淋巴细胞的表达	77-79
3．2．2 CD23阳性率测定结果	79-80
3．3 NF-κB p65 的测定	80-83
3．3．1 NF-κB p65在小鼠肺组织的表达	80-81
3．3．2 NF-κB p65阳性率测定结果	81-83
4 讨论	83-84
5 小结	84-86
第六章肝素寡糖与细胞因子的结合实验	86-103
1 材料	86
1．1 试剂	86
1．2 仪器	86
2 方法	86-88
2．1 酶联免疫测定法	86
2．1．1 肝素寡糖与细胞因子结合	86
2．1．2 细胞因子含量的测定	86
2．2 IL-4、IL-5和肝素寡糖的 ATR-FTIR测定	86-88
2．2．1 波谱采集	86-87
2．2．2 谱图分析	87-88
3 结果	88-98
3．1 酶联免疫测定肝素寡糖与 IL-4、IL-5含量	88-91
3．1．1 肝素寡糖与细胞因子结合最适浓度	88
3．1．2 三种肝素寡糖与 IL-4结合测定结果	88-90
3．1．3 三种肝素寡糖与 IL-5结合测定结果	90-91
3．2 肝素寡糖Olig BH．7与 IL-4、IL-5的 ATR-FTIR测定结果	91-98
3．2．1 肝素寡糖Olig BH．7与 IL-4结合 ATR-FTIR测定结果	91-94
3．2．2 肝素寡糖Olig BH．7与 IL-5结合 ATR-FTIR测定结果	94-98
4 讨论	98-102
5 小结	102-103
总结	103-105
附录	105-115
参考文献	115-125
致谢	125-126
攻读硕士学位期间发表的学术论文	126-127
学位论文评阅及答辩情况表	127

【DOI】

LunWen.ID:2.2008.198471



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