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海洋细菌Cellulophaga sp. QY201的卡拉胶酶研究

作者：拜晶晶 Publish: 2007-1-9 Hits:-

【中文题名】

海洋细菌Cellulophaga sp. QY201的卡拉胶酶研究

【英文题名】

Investigation of Carrageenase from Marine Bacterium Cellulophaga sp. QY201

【学科专业】

生药学

【论文级别】

硕士论文

【投稿时间】

2007-1-9

【中关键词】

卡拉胶酶,海洋细菌,菌种鉴定,分离纯化,,

【英关键词】

carrageenanase,marine bacterium,identification,purification,

【分类导航】

医药、卫生>药学>药物基础科学>>>

【论文摘要】

卡拉胶是一种红藻多糖，主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等生物的细胞壁中。卡拉胶是由1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。目前能够工业化生产的主要有κ-型、ι-型和λ-型三种卡拉胶，并已广泛应用于食品、化工等行业。近年来，人们发现不同聚合度的卡拉胶寡糖具有多种药理活性，有望发展为新一代的海洋药物。卡拉胶多糖的降解通常有酸水解和酶解两种方法，其中酶解反应条件温和、专一性强，已受到广泛关注。目前国内外对κ-卡拉胶酶研究较多，而对ι-和λ-卡拉胶酶的研究报道很少。因此，高活性、高特异性的ι-和λ-卡拉胶酶的发现具有重要理论意义和广阔应用前景。本论文利用以卡拉胶作为唯一碳源的选择性培养基，从青岛近海筛选高产卡拉胶酶菌株。已发现298株产酶菌株，其中菌株QY201同其它菌株相比，具有酶活高、降解速度快、能同时分泌出κ-、ι-、λ-卡拉胶酶等特点，因此我们以它作为研究对象进行了本课题的研究工作。菌株QY201为革兰氏阴性菌，短杆状，可运动；菌落黄色，圆形，表面光滑，粘质。采用基于16S rDNA的分子系统学技...

【论文题纲】

Abstract	9-12
摘要	12-14
一.文献综述	14-32
1 卡拉胶	14-20
1.1 卡拉胶的结构与分类	14-17
1.2 卡拉胶的来源	17
1.3 卡拉胶的生物合成	17
1.4 卡拉胶的胶凝特性	17-18
1.5 卡拉胶的应用	18-20
1.5.1 卡拉胶在医药方面的应用	18-20
1.5.2 卡拉胶在工业、食品方面的应用	20
2 卡拉胶酶	20-31
2.1 卡拉胶酶的分类及来源	21
2.2 酶解卡拉胶	21
2.3 卡拉胶酶的作用机理	21-25
2.4 卡拉胶酶酶活性的检测方法	25
2.5 卡拉胶酶的分离纯化与性质研究	25-30
2.6 卡拉胶酶的应用	30-31
3 小结	31-32
二、菌株的分离鉴定	32-41
1 材料与方法	32-37
1.1 材料	32
1.2 样品的采集	32
1.3 菌种的分离	32-33
1.3.1 富集培养	32
1.3.2 初筛	32-33
1.3.3 复筛	33
1.4 卡拉胶酶活力测定	33
1.5 菌株形态的观察	33
1.6 16S rRNA基因的克隆与序列测定	33-37
1.6.1 细菌DNA的制备	33-34
1.6.2 质粒pBlue-script Ⅱ KS(+)的制备	34-35
1.6.3 pBlue-script Ⅱ KS(+)—T载体的制备	35-36
1.6.4 16S rRNA基因的PCR扩增及PCR产物的克隆	36
1.6.5 序列测定	36-37
1.6.6 数据分析	37
2 结果	37-40
2.1 筛选结果	37
2.2 形态特征	37
2.3 生长条件	37-38
2.4 16S rRNA基因的克隆	38
2.5 16S rRNA基因序列分析和系统发育	38-40
3 讨论	40-41
三、菌株QY201的发酵条件优化	41-45
1 材料与方法	41-42
1.1 材料	41
1.2 培养条件	41
1.3 培养时间、培养基体积、转速的正交实验	41
1.4 培养基成分的正交实验	41
1.5 卡拉胶酶活力测定	41-42
2 结果	42-44
2.1 培养时间、培养基体积、转速优化	42
2.2 培养基成分优化	42-44
3 讨论	44-45
四、卡拉胶酶的分离纯化与性质分析	45-60
1 材料和方法	45-50
1.1 材料和仪器	45
1.2 粗酶液的制备	45-46
1.3 酶的分离纯化	46-47
1.3.1 丙酮沉淀粗分离	46
1.3.2 离子交换层析	46
1.3.3 凝胶过滤层析	46-47
1.4 酶活检测方法	47
1.5 蛋白质浓度测定方法	47
1.6 SDS-PAGE	47
1.7 PAGE糖电泳	47-48
1.8 卡拉胶酶的生化性质检测	48-49
1.8.1 反应最适温度	48
1.8.2 温度对酶活稳定性的影响	48
1.8.3 反应最适pH	48
1.8.4 pH对酶活稳定性的影响	48
1.8.5 EDTA、金属离子对酶活性的影响	48-49
1.8.6 底物特异性实验	49
1.8.6.1 Zomygram法测定酶活	49
1.8.6.2 DNS法、紫外吸收法测定酶活	49
1.8.7 Km值的测定	49
1.9 卡拉胶酶的产物分析	49-50
2 结果	50-58
2.1 ι-卡拉胶酶分离纯化	50-52
2.1.1 离子交换层析	50-51
2.1.2 凝胶过滤层析	51-52
2.1.3 SDS-PAGE电泳	52
2.2 卡拉胶酶的性质分析	52-57
2.2.1 温度对酶活性的影响	52-54
2.2.2 pH对酶活性的影响	54
2.2.3 EDTA、金属离子对酶活性的影响	54-55
2.2.4 酶的底物特异性	55-57
2.2.4.1 Zomygram法测定酶活	55-56
2.2.4.2 酶活力测定	56-57
2.2.5 Km值的测定	57
2.3 卡拉胶酶的降解产物分析	57-58
3 讨论	58-60
五、总结与展望	60-61
六、参考文献	61-67
七、致谢	67-68
八、发表文章	68

【DOI】

LunWen.ID:2.2008.199533



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