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N-端聚乙二醇化L-门冬酰胺酶的制备、纯化及鉴定研究

作者：府旗中 Publish: 2007-3-30 Hits:-

【中文题名】

N-端聚乙二醇化L-门冬酰胺酶的制备、纯化及鉴定研究

【英文题名】

Studies on the Preparation, Purification and Identification of N-terminal Site-Specific Mono-PEGylation of L-Asparaginase

【学科专业】

生物医学工程

【论文级别】

硕士论文

【投稿时间】

2007-3-30

【中关键词】

左旋门冬酰胺酶,聚乙二醇修饰,分离纯化,鉴定,,

【英关键词】

L-asparaginase,PEGylation,separation&purification,identification,

【分类导航】

医药、卫生>药学>药物基础科学>>>

【论文摘要】

左旋门冬酰胺酶(L-ASP)是一种白色或微黄色冻干粉未,无嗅、无味,由4个亚基组成的同型四聚体,其相对分子量为133000±5000,主要作用是把血清中的门冬酰胺水解为门冬氨酸和氨,临床上主要用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)。急性白血病等肿瘤细胞会因既不能从血中取得足够门冬酰胺,亦不能自身合成,使其蛋白质合成受障碍,增殖受抑制,细胞大量破坏而不能生长、存活;正常细胞有自身合成门冬酰胺的功能而不受影响。本品亦能干扰细胞DNA、RNA的合成,可能作用于细胞G1增殖周期中。在临床应用上,重组L-ASP与其它的重组制品一样具有半衰期短、有较强的免疫原性、毒副作用大等缺点。由于体内半衰期较短,需要每天注射才能维持有效的血药浓度。结果长期而频繁的注射,增加了治疗成本,给患者带来严重的痛苦和不便,降低了依从性,加重了病人的经济负担。为了克服L-ASP在临床用药上的限制,本课题选择单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)对左旋门冬酰胺酶(L-ASP)进行N-末端定位修饰,通过增大其分子量,降低肾脏消除率,提高药物体内半衰期;偶联PEG的立体屏蔽效应,减缓了胰蛋白酶的降解,同时也使其免疫原性大大降低...

【论文题纲】

摘要	3-5
ABSTRACT	5-9
1 绪论	9-13
1.1 门冬酰胺酶应用状况	9-10
1.2 PEG 化概述	10-11
1.3 研究目的和意义	11
1.4 主要研究内容及技术路线	11-13
2 实验材料与方法	13-26
2.1 主要实验材料	13-14
2.2 主要试剂的配置	14-17
2.2.1 L-ASP 原酶溶液配置	14-15
2.2.2 mPEG-丙醛配置	15
2.2.3 NaCNBH_3 溶液配置	15
2.2.4 SDS-PAGE 溶液	15
2.2.5 凝胶过滤缓冲液	15
2.2.6 离子交换缓冲液	15-16
2.2.7 反相色谱缓冲液	16
2.2.8 酶活力测定溶液	16
2.2.9 水平等电聚焦溶液	16
2.2.10 Western Blot 溶液	16-17
2.3 主要实验仪器	17-18
2.4 实验方法	18-26
2.4.1 mPEG－ButyALD-20000 与 L-Asp 修饰反应及反应产物分析	18-20
2.4.2 PEG-L-ASP 的分离纯化	20
2.4.3 PEG-L-ASP 含量测定	20-22
2.4.4 酶活力测定	22
2.4.5 PEG-L-ASP 鉴定	22-26
3 结果与讨论	26-46
3.1 PEG-L-ASP 的制备工艺研究	26-32
3.1.1 偶联修饰剂的选择	26
3.1.2 mPEG 修饰L-ASP 的工艺优化	26-32
3.2 PEG-L-ASP 的分离纯化	32-38
3.2.1 阴离子交换色谱粗分离L-ASP 和PEG-L-ASP 偶联物	32-35
3.2.2 凝胶过滤色谱精纯化PEG-L-ASP	35-37
3.2.3 Sephadex G-25 脱除游离小分子	37
3.2.4 修饰产物纯化前后SDS-PAGE 电泳比较	37-38
3.3 PEG-L-ASP 的结构确证和理化性质	38-45
3.3.1 Bradford 法测蛋白含量	38-39
3.3.2 酶活力测定	39
3.3.3 紫外扫描分析	39-40
3.3.4 荧光胺法测修饰度分析	40-42
3.3.5 等电点测定	42
3.3.6 Western Blot 免疫印迹分析	42-43
3.3.7 胰蛋白酶肽图分析	43-45
3.4 小结	45-46
4 结论与展望	46-49
4.1 结论	46-47
4.2 展望	47
4.3 创新点	47-49
致谢	49-50
参考文献	50-54
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录	54-55
附件A：L-门冬酰胺酶的结构与修饰	55-62
附件B：蛋白质的PEG 修饰	62-66

【DOI】

LunWen.ID:2.2008.199576



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