| 【中文题名】 | 拟组织化培养肝细胞用作药物筛选模型的可行性研究 |
| 【英文题名】 | Research on the Feasibility of Tissue-like Cultured Hepatocytes in Drug Screening |
| 【学科专业】 | 生物化工 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2007-7-10 |
| 【中关键词】 | 凝胶包埋培养,单层贴壁培养,他克宁,冷冻保存,CYP450,GST |
| 【英关键词】 | gel entrapment culture,monolayer culture,tacrine,cryopreservation,CYP450,GST, |
| 【分类导航】 | 医药、卫生>药学>药理学>实验药理学>药物筛选和实验模型> |
| 【论文摘要】 |
本论文采用肝细胞的拟组织化凝胶包埋培养方式，主要从药物代谢和药物肝毒性两个方面来研究其用于药物筛选的可行性。
本论文首先考察了大鼠肝细胞凝胶包埋与作为对照培养模型的单层贴壁细胞的CYP1A2、CYP2B、CYP3A和Ⅱ相酶中GST的活性。通过比较，发现凝胶包埋细胞比单层贴壁培养细胞能更好地保持各项药物代谢酶的活性。
其次，本文采用超低温保存方法来解决肝细胞无法增殖的实际问题，通过观察超低温冻存后大鼠肝细胞在两种培养模型下的CYP1A2、CYP2B、CYP3A和Ⅱ相酶GST酶活表达情况，发现冻存细胞复苏后仍在凝胶包埋培养中保持比平板贴壁细胞更好的酶活性。
本文还采用了大鼠肝细胞凝胶包埋这一培养模型系统研究了药物他克宁(tacrine，THA)的毒性机理，并与传统的单层贴壁培养比较，揭示了他克宁毒性与CYP1A2及GSH关系方面的新的发现，有助于解决了一些由相互矛盾的文献报道结果所引起的困惑。
最后，为了比较大鼠和人之间的种属差异，更真实地反映药物在人体内的代谢情况，本文还利用少量的人肝细胞重复了一部分代谢及他克宁毒性的实验，结果发现人肝细胞实验结果与大鼠肝细胞相似，只是... |
| 【论文题纲】 |
|
目录 |
3-5 |
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摘要 |
5-6 |
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Abstract |
6-7 |
|
前言 |
7-9 |
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第一章 文献综述 |
9-22 |
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1 药物代谢与药物肝毒性 |
9-17 |
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1.1 药物代谢 |
9-15 |
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1.1.1 Ⅰ相酶 |
11-14 |
|
1.1.2 Ⅱ相酶 |
14-15 |
|
1.2 药物肝毒性 |
15-17 |
|
2 肝细胞体外培养 |
17-19 |
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2.1 肝细胞单层贴壁培养 |
17-18 |
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2.2 肝细胞凝胶包埋培养 |
18 |
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2.3 肝细胞聚球体形式培养 |
18-19 |
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3 肝细胞的冷冻保存 |
19-20 |
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4 研究思路 |
20-22 |
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第二章 材料与方法 |
22-29 |
|
2.1 实验材料、试剂及细胞培养基 |
22-24 |
|
2.1.1 主要实验器材 |
22 |
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2.1.2 主要实验试剂 |
22-23 |
|
2.1.3 主要实验溶液 |
23-24 |
|
2.1.3.1 灌注液Ⅰ |
23 |
|
2.1.3.2 灌注液Ⅱ |
23 |
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2.1.3.3 低碳酸盐培养基 |
23 |
|
2.1.3.4 大鼠肝细胞培养基 |
23 |
|
2.1.3.5 缓冲液Krebs Henseleit(KHB) |
23 |
|
2.1.3.6 磷酸缓冲液(PBS) |
23-24 |
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2.1.3.7 浓缩培养基 |
24 |
|
2.2 原代大鼠肝细胞收获及其培养方法 |
24-25 |
|
2.2.1 原代大鼠肝细胞的收获 |
24 |
|
2.2.2 原代大鼠肝细胞的单层贴壁培养 |
24 |
|
2.2.3 原代大鼠肝细胞的胶原凝胶包埋培养 |
24-25 |
|
2.3 人肝细胞的培养 |
25 |
|
2.4 大鼠肝细胞冷冻保存和复苏 |
25-26 |
|
2.4.1 肝细胞冷冻保存 |
25 |
|
2.4.2 冻存后细胞复苏 |
25-26 |
|
2.5 测定及分析方法 |
26-29 |
|
2.5.1 细胞活率测定(MTT法) |
26 |
|
2.5.2 肝细胞酶活的测定 |
26-27 |
|
2.5.3 肝细胞药物诱导测定 |
27 |
|
2.5.4 肝细胞药物抑制测定 |
27 |
|
2.5.5 胞内GSH及ROS水平测定含量测定 |
27 |
|
2.5.6 尿素和大鼠白蛋白测定 |
27-28 |
|
2.5.7 统计学处理 |
28-29 |
|
第三章 代谢酶活的研究 |
29-42 |
|
3.1 CYP1A2 |
29-33 |
|
3.1.1 新鲜大鼠肝细胞的CYP1A2的酶活 |
29-32 |
|
3.1.1.1 CYP1A2的酶活曲线及基因表达 |
29-30 |
|
3.1.1.2 CYP1A2的诱导与抑制 |
30-32 |
|
3.1.2 冻存后大鼠肝细胞的CYP1A2酶活 |
32-33 |
|
3.2 CYP2B |
33-36 |
|
3.2.1 新鲜大鼠肝细胞的CYP2B的酶活 |
34-35 |
|
3.2.1.1 CYP2B的酶活曲线 |
34 |
|
3.2.1.2 苯巴比妥对CYP2B的诱导 |
34-35 |
|
3.2.2 冻存后大鼠肝细胞的CYP2B的酶活 |
35-36 |
|
3.3 CYP3A |
36-38 |
|
3.3.1 新鲜大鼠肝细胞的CYP3A的酶活 |
36-37 |
|
3.3.1.1 CYP3A的酶活曲线 |
36-37 |
|
3.3.1.2 苯巴比妥对CYP3A的诱导 |
37 |
|
3.3.2 冻存后大鼠肝细胞的CYP3A的酶活 |
37-38 |
|
3.4 Ⅱ相酶GST |
38-40 |
|
3.4.1 新鲜大鼠肝细胞的GST酶活 |
38-39 |
|
3.4.2 冻存后大鼠肝细胞的GST酶活 |
39-40 |
|
3.5 小结与讨论 |
40-42 |
|
第四章 大鼠肝细胞的他克宁肝毒性研究 |
42-52 |
|
4.1 他克宁对细胞活率的影响 |
42-43 |
|
4.2 他克宁对细胞GSH及ROS水平的影响 |
43-45 |
|
4.3 他克宁对细胞白蛋白和尿素合成的影响 |
45-46 |
|
4.4 氟伏沙明对他克宁毒性的抑制 |
46-47 |
|
4.5 甘草酸对他克宁的保肝作用 |
47-50 |
|
4.6 小结与讨论 |
50-52 |
|
第五章 人肝细胞的部分代谢酶活及他克宁肝毒性研究 |
52-57 |
|
5.1 人肝细胞CYP3A4的酶活研究 |
52-53 |
|
5.2 人肝细胞用于他克宁毒性的研究 |
53-56 |
|
5.2.1 他克宁对人肝细胞活率的影响 |
53-54 |
|
5.2.2 他克宁对人肝细胞GSH的影响 |
54-55 |
|
5.2.3 甘草酸对人肝细胞的保肝作用 |
55-56 |
|
5.3 小结与讨论 |
56-57 |
|
第六章 结论与展望 |
57-59 |
|
参考文献 |
59-67 |
|
硕士期间主要成果 |
67-68 |
|
致谢 |
68 |
|
| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.199650 |
