| 【中文题名】 | 5-酮基阿维菌素基因工程菌的研究 |
| 【英文题名】 | The Studies on the Gene-engineered Strain Producing 5-O-avermectins |
| 【学科专业】 | 微生物与生化药学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2007-9-29 |
| 【中关键词】 | 阿维链霉菌,阿维菌素,5-酮阿维菌素,基因失活,, |
| 【英关键词】 | Streptomyces avermitilis,avermectins,5-O-avermectins,gene disruption, |
| 【分类导航】 | 医药、卫生>药学>药物基础科学>药物生物学>> |
| 【论文摘要】 |
阿维菌素(Avermectin)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的十六元大环内酯类抗生素。阿维菌素具有广谱、高效的抗寄生虫活性，对宿主不良反应极低，是目前理想的驱虫、杀虫药物。此外，以阿维菌素为原料，再进行化学合成可得到一系列的半合成阿维菌素。
本论文利用分子生物学的方法，通过对阿维菌素生物合成基因aveF基因的失活，得到了产生5-酮阿维菌素的基因工程菌株，为化学合成新的阿维菌素衍生物提供了可利用的原料来源。此外，本论文还对阿维菌素生物合成基因簇中aveC基因的功能进行了探索。
首先，根据文献报导的aveF基因及其上下游核苷酸序列，设计了PCR引物，并扩增出了含有aveF基因的1.8kb DNA片段。将该DNA片段连接到pMD18-T载体后，将1.5kb的安普霉素抗性基因插入到该片段aveF基因的SalI位点，然后再将该3.3kbDNA片段切出，插入到具有接合转移功能的链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒pHJL401的多克隆位点，得到重组质粒pPC5。
将重组质粒pPC5通过接合转移导入到阿维链霉菌后，经过筛选对安普霉素具有抗性而对硫链丝菌素敏感的... |
| 【论文题纲】 |
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中文摘要 |
10-11 |
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英文摘要 |
11-13 |
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第一章 前言 |
13-24 |
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1.1 阿维菌素概述 |
13-15 |
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1.2 阿维菌素的安全性 |
15 |
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1.3 阿维菌素的生物合成 |
15-20 |
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1.3.1 阿维菌素的合成途径 |
15-17 |
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1.3.2 阿维菌素生物合成的基因簇及有关酶 |
17-20 |
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1.4 阿维菌素生产菌的遗传改良 |
20-22 |
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1.4.1 选择性生产阿维菌素B_(1a),B_(2a) |
20 |
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1.4.2 选择性产生5-酮阿维菌素B_(1a),B_(2a) |
20-21 |
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1.4.3 阿维菌素B_(2a)的选择性产出 |
21 |
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1.4.4 选择性产生6,8a-开环-6,8a-脱氧阿维菌素 |
21 |
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1.4.5 选择性产生C25不同的新型阿维菌素 |
21-22 |
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1.4.6 有毒化合物Oligomycin的去除 |
22 |
|
1.5 阿维菌素的结构改造 |
22-23 |
|
1.6 本研究的立题依据、目的与意义 |
23-24 |
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1.6.1 研究背景 |
23 |
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1.6.2 目的与意义 |
23-24 |
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第二章 实验材料与方法 |
24-33 |
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实验材料 |
24-28 |
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2.1.1 菌种与质粒 |
24 |
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2.1.2 培养基 |
24-25 |
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2.1.3 试剂 |
25-26 |
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2.1.4 溶液 |
26-27 |
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2.1.5 主要仪器 |
27-28 |
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实验方法 |
28-33 |
|
2.2.1 大肠杆菌质粒DNA小量提取 |
28 |
|
2.2.2 链霉菌总DNA的提取 |
28-29 |
|
2.2.3 大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备和DNA转化 |
29 |
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2.2.4 DNA酶切和连接 |
29-30 |
|
2.2.5 DNA电泳和凝胶片段回收 |
30 |
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2.2.6 PCR反应 |
30-31 |
|
2.2.7 接合转移及双交换菌株的筛选 |
31-32 |
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2.2.8 发酵产物的提取及检测 |
32-33 |
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第三章 实验结果与讨论 |
33-51 |
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第一部分 5-酮阿维菌素基因工程菌的构建 |
33-44 |
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3.1.1 构建5-酮阿维菌素基因工程菌的理论依据 |
33-35 |
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3.1.2 插入失活质粒pPC5的构建 |
35-39 |
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3.1.3 接合转移 |
39 |
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3.1.4 双交换菌株的筛选 |
39 |
|
3.1.5 重组菌株发酵产物的HPLC分析 |
39-41 |
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3.1.6 对重组菌株的验证 |
41-42 |
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3.1.7 小结 |
42-44 |
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第二部分 只产阿维菌素"2"组分的基因工程菌株的构建 |
44-51 |
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3.2.1 插入失活质粒pMYS5的构建 |
44-48 |
|
3.2.2 接合转移 |
48 |
|
3.2.3 双交换菌株的筛选 |
48 |
|
3.2.4 重组菌株发酵产物的HPLC分析 |
48-49 |
|
3.2.5 对重组菌株的验证 |
49-50 |
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3.2.6 小结 |
50-51 |
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第四章 结论 |
51-52 |
|
参考文献 |
52-54 |
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致谢 |
54-55 |
|
附录 |
55-58 |
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| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.199879 |
