| 【中文题名】 | 应用基因工程技术优化必特螺旋霉素组分 |
| 【英文题名】 | Optimize the Components of Biotechmycin by Genetic Engineering |
| 【学科专业】 | 微生物与生化药学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2007-9-29 |
| 【中关键词】 | 必特螺旋霉素,异戊酰基转移酶,单引物巢式PCR,异戊酰螺旋霉素I,, |
| 【英关键词】 | Biotechmycins,isovaleryltransferase,single oligonucleotide nested PCR,isovalerylspiramycin I, |
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| 【论文摘要】 |
必特螺旋霉素(BT)是利用基因工程技术对螺旋霉素(SP)的碳霉糖4″-羟基进行酰化获得的以4″异戊酰SP为主组分的新抗生素，组分比较复杂，原因有两个：首先是SP本身有三个组分(SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ)，其次是异戊酰化SP的异戊酰基转移酶特异性有限。本论文从减少SP组分数量入手，实现减少BT组分的目的，为今后简化BT提取工艺、推进产业化做出贡献。
在SP三个组分中，SPⅡ和SPⅢ是SPⅠ分别乙酰化和丙酰化的产物，并且由同一个酶(3-O-酰基转移酶，编码基因称为sspA)催化完成。因此，如果将该酶基因替换为酰化效率和酰化专一性更高的酶基因，可以显著减少SP的组分数量；如果将该酶基因破坏，则SP由三个组分变为一个组分(SPⅠ)，也将显著减少SP的组分数量。本论文正是围绕这种构思进行。
实施上述构思均需要利用DNA同源双交换技术，以实现基因阻断或基因替换的目的。因此，获得SP生物合成中的sspA基因及其侧翼序列是必需的。麦迪霉素、碳霉素与SP的结构非常相似。我们根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶(3-O-AT)序列，设计了简并性PCR引物，以SP产生菌S. spiramyce... |
| 【论文题纲】 |
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摘要 |
10-11 |
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ABSTRACT |
11-13 |
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第一章 前言 |
13-27 |
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1.1 十六元大环内酯类抗生素介绍 |
13-23 |
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1.2 改善抗生素组分的生物学方法 |
23-25 |
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1.3 本论文立题方向 |
25-27 |
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第二章 材料与方法 |
27-36 |
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2.1 材料部分 |
27-31 |
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2.1.1 菌种 |
27 |
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2.1.2 载体 |
27 |
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2.1.3 特殊试剂与酶 |
27 |
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2.1.4 特殊仪器 |
27-28 |
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2.1.5 培养基 |
28-30 |
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2.1.6 缓冲液 |
30 |
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2.1.7 生物信息学分析工具 |
30-31 |
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2.2 方法部分 |
31-36 |
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2.2.1 E.coli质粒DNA小量提取 |
31 |
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2.2.2 E.coli质粒DNA大量提取 |
31 |
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2.2.3 限制酶切反应 |
31 |
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2.2.4 DNA电泳及片段回收 |
31 |
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2.2.5 DNA连接反应 |
31 |
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2.2.6 E.coli感受态细胞的制备 |
31-32 |
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2.2.7 质粒DNA转化E.coli感受态细胞 |
32 |
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2.2.8 E.coli转化子的快速鉴定 |
32 |
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2.2.9 链霉菌原生质体的制备、再生及DNA转化原生质体 |
32-33 |
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2.2.10 链霉菌总DNA提取方法 |
33 |
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2.2.11 少量快速提取链霉菌总DNA |
33 |
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2.2.12 常规PCR反应 |
33-34 |
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2.2.13 SON-PCR反应 |
34 |
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2.2.14 发酵液处理及抗生素组分分析 |
34-35 |
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2.2.15 高效液相色谱分析 |
35-36 |
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第三章 结果与讨论 |
36-55 |
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3.1 螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因部分序列的克隆 |
36-38 |
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3.2 采用单寡核苷酸巢式PCR(SON-PCR)方法克隆酰基转移酶基因两翼序列 |
38-43 |
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3.3 螺旋霉素sspA的完全删除 |
43-46 |
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3.3.1 sspA基因缺失重组载体的构建 |
43-44 |
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3.3.2 sspA基因缺失变株的筛选与鉴定 |
44-46 |
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3.4 mdmB基因的替换 |
46-50 |
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3.4.1 含有mdmB基因的重组载体的构建 |
47 |
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3.4.2 mdmB基因替换变株的筛选与鉴定 |
47-50 |
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3.5 主要产生异戊酰螺旋霉素Ⅰ的产生菌的获得 |
50-55 |
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3.5.1 载体的构建 |
50-51 |
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3.5.2 sspA基因阅读框内失活变株的筛选与鉴定 |
51-55 |
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第四章 结论 |
55-56 |
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参考文献 |
56-59 |
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致谢 |
59-60 |
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附录 |
60-67 |
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| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.199891 |
