| 【中文题名】 | 利用噬菌体展示随机环七肽库筛选HPA小肽抑制剂 |
| 【英文题名】 | Selecting Heperase Micromolecule Peptide Inhibitor from a Phage Display Peptide Library |
| 【学科专业】 | 微生物与生化药学 |
| 【论文级别】 | 硕士论文 |
| 【投稿时间】 | 2007-9-29 |
| 【中关键词】 | 噬菌体展示随机环七肽库,HPA,Transwell,侵袭,, |
| 【英关键词】 | phage display random peptide library,HPA,Transwell,invasion, |
| 【分类导航】 | 医药、卫生>肿瘤学>一般性问题>肿瘤病理学、病因学>> |
| 【论文摘要】 |
癌症成为致命的疾病，不仅在于癌细胞的恶性增殖，更在于其转移能力。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是参与细胞外基质及基底膜降解而帮助癌细胞在人体内肆虐的关键酶，故成为许多抑制剂作用的靶标。HPA是裂解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和细胞基底膜(basement membrane，BM)中乙酰硫酸肝素盐蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycan，HSPG)中乙酰硫酸肝素盐(heparin sulphate，HS)的内源葡萄糖醛酸酶的统称。80年代中期首次发现HPA与肿瘤转移的关系，但由于其性质不稳定，缺乏快速、简便的检测方法，纯化非常困难，阻碍了它的发展。近年来多家实验室独立克隆出其基因，为研究肿瘤转移开辟了一个很有潜力的领域。
据文献报道，本室设计引物PCR合成出HPA小亚基基因序列，并实现了其在大肠杆菌中的高效表达。经过Histrap FF柱纯化，蛋白纯度达98％以上。采用固相筛选法，以HPA小亚基为靶蛋白，从噬菌体展示随机多肽库中筛选HPA小肽抑制剂。经5轮筛选，对HPA小亚基蛋白具有亲和力的噬菌体富集了约1000倍。从后... |
| 【论文题纲】 |
|
摘要 |
10-11 |
|
Abstract |
11-13 |
|
前言 |
13-18 |
|
第一章 靶蛋白HPA小亚基的表达和纯化 |
18-37 |
|
1.材料与方法 |
18-29 |
|
1.1 材料 |
18-19 |
|
1.2 主要培养基和溶液的配制 |
19-21 |
|
1.3 主要仪器 |
21 |
|
1.4 设计合成引物 |
21-22 |
|
1.5 PCR扩增目的条带 |
22-23 |
|
1.6 重组质粒的构建 |
23-26 |
|
1.7 HPA小亚基蛋白的表达 |
26-28 |
|
1.8 蛋白的纯化 |
28-29 |
|
1.9 Folin-酚试剂法测定蛋白浓度 |
29 |
|
2.结果与讨论 |
29-37 |
|
2.1 HPA小亚基的PCR结果 |
29-30 |
|
2.2 HPA小亚基蛋白的诱导表达、分离纯化 |
30-34 |
|
2.3 HPA小亚基蛋白的透析复性 |
34-35 |
|
2.4 结论 |
35 |
|
2.5 讨论 |
35-37 |
|
第二章 噬菌体展示随机肽库的筛选及初步鉴定 |
37-54 |
|
1.材料与方法 |
37-43 |
|
1.1 菌株、蛋白和抗体库 |
37-38 |
|
1.2 酶和主要生化试剂 |
38 |
|
1.3 主要培养基和溶液的配制 |
38-39 |
|
1.4 主要仪器 |
39 |
|
1.5 靶抗原蛋白的处理 |
39 |
|
1.6 噬菌体展示随机环七肽库的筛选 |
39-41 |
|
1.7 ELISA筛选噬菌体阳性克隆 |
41-43 |
|
1.8 阳性噬菌体克隆的DNA序列测定及同源性分析 |
43 |
|
2.结果与讨论 |
43-54 |
|
2.1 噬菌体展示随机环七肽库筛选回收率 |
43-45 |
|
2.2 噬菌体单克隆样品的亲和力鉴定 |
45-48 |
|
2.3 ssDNA及短肽氨基酸序列分析 |
48-52 |
|
2.4 结论 |
52 |
|
2.5 讨论 |
52-54 |
|
第三章 小分子多肽的合成与活性测定 |
54-67 |
|
1.材料与方法 |
55-58 |
|
1.1 细胞株 |
55 |
|
1.2 主要试剂 |
55 |
|
1.3 主要细胞培养基及溶液配制 |
55-56 |
|
1.4 主要仪器 |
56 |
|
1.5 实验方法 |
56-58 |
|
2.结果与讨论 |
58-67 |
|
2.1 化学合成环七肽P1和P8的鉴定图谱 |
58-63 |
|
2.2 肿瘤细胞体外侵袭模型的建立 |
63-64 |
|
2.3 样品对HepG-2细胞体外侵袭行为的影响 |
64-65 |
|
2.4 结论 |
65-66 |
|
2.5 讨论 |
66-67 |
|
讨论 |
67-71 |
|
一、HPA小亚基蛋白的高浓度透析复性 |
67 |
|
二、噬菌体展示随机多肽库技术及本课题的意义 |
67-68 |
|
三、噬菌体展示随机环七肽库筛选实验方法及结果分析 |
68-69 |
|
四、体外重组基底膜试验检测筛选小肽活性 |
69-71 |
|
参考文献 |
71-76 |
|
致谢 |
76-77 |
|
附录 |
77 |
|
| 【DOI】 | LunWen.ID:2.2008.193890 |
